中国学者在ADA舞台上传递的“中国之声”亦是大会看点之一。下面让我们先来看看来自中山大学附属第三医院曾文博士代表曾龙驿教授团队分享的“改善诱导的胰岛β细胞和功能障碍”报告。

        摘要

中山大学附属第三医院曾文博士

        脂毒性导致的胰岛素分泌功能障碍是2型糖尿病发病的重要原因之一。因此，保护胰腺β细胞的数目和功能是糖尿病研究的长期目标。以往研究表明，膜蛋白中小凹蛋白1(Caveolin-1)与β细胞凋亡和胰岛素分泌有关，但其中机制仍不清楚。本研究的目的是探讨Cav-1沉默是否保护脂毒性下的胰腺β细胞及潜在机制。我们研究发现，Caveolin-1(Cav-1)沉默可以显著促进β细胞增殖，抑制棕榈酸酯(PA)诱导的胰腺β细胞凋亡并增强胰岛素的产生和葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。这些作用与其激活Akt和ERK1/2、抑制细胞周期抑制分子(FOXO1，GSK3β，P21，P27和P53)的表达并促进Cyclin D2和Cyclin D3的表达有关。随后，通过抑制PI3K/Akt和ERK/MAPK信号通路阻断了Cav-1沉默对β细胞数目的保护作用。而且，PA可以诱导内质网(ER)应激，但Cav-1沉默后显著降低了eIF2α磷酸化和ER应激反应标志物BiP和CHOP的表达，而这些标志物可以增强细胞对脂毒性的敏感性。此外，通过电镜观察到Cav-1沉默改善了脂毒性下的自噬功能障碍，这个现象与其引起Lc3b mRNA、LC3-II和LC3-II/LC3-I蛋白的表达上调、p62表达下调以及mTOR通路被抑制的结果相一致。我们的研究结果表明，Cav-1沉默可以降低脂毒性诱导的β细胞凋亡和改善胰岛素分泌功能障碍。因此，Cav-1可能作为未来T2DM治疗中潜在的靶点。

        专家点评

中山大学附属第三医院曾龙驿教授

        关键点1:Cav-1沉默促进了胰岛β细胞的增殖和胰岛素产生

        为了确定Cav-1沉默是否影响NIT-1细胞和小鼠胰岛细胞的增殖，我们进行了ki-67免疫荧光染色实验。结果显示，PA的处理显著抑制了NIT-1细胞和小鼠胰岛细胞增殖，而不管有或没有0.5mM的PA处理，沉默Cav-1均可促进NIT-1细胞和胰岛细胞的增殖。同时，PA处理抑制了NIT-1细胞和胰岛中Cyclin D2和Cyclin D3的表达水平。而沉默Cav-1后，无论有否PA处理，NIT-1细胞和胰岛中的Cyclin D2和Cyclin D3的表达显著增加。以上这些结果表明，沉默Cav-1的的NIT-1细胞和胰岛均具有更高的增殖活性。由于正常的小鼠胰岛增殖效率非常低，所以Cav-1沉默诱导的β细胞增殖有一定的价值。

        研究表明，长期暴露在PA环境下可以导致胰腺β细胞功能障碍。我们随后研究了Cav-1沉默在胰岛素分泌中的作用。结果表明，无论有否PA处理，Cav-1沉默组与对照组相比，胰岛素mRNA表达和胰岛总胰岛素含量升高均超过2-3倍。

        关键点2:Cav-1沉默抑制了PA诱导的胰岛β细胞的GSIS功能失调和凋亡

        此外，我们发现PA处理可以增加基础条件下的胰岛素分泌，但对16.7mM葡萄糖刺激无反应，说明PA处理引起了GSIS功能障碍，胰岛对葡萄糖浓度的变化敏感性下降。但是，Cav-1沉默成功逆转了PA引起的高浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌功能障碍，并且在GSIS测定中仍然保持了2倍以上的胰岛素分泌增加量。总之，这些结果表明Cav-1沉默可以改善PA刺激下的胰岛的胰岛素分泌功能障碍。

        另外，通过流式细胞术分析发现，PA处理可以显著增加NIT-1细胞凋亡，而敲除Cav-1后，细胞凋亡明显减少。同样的结果也在Hoechst 33342/PI染色法和TUNEL染色法中被证实。此外，PA处理引起的caspase3剪切体的增加也被Cav-1沉默显著抑制。这些结果表明，Cav-1沉默可以抑制PA诱导的胰腺β细胞凋亡。

        为了研究Cav-1沉默促进β细胞增殖、胰岛素分泌和抑制其凋亡的潜在机制，我们检测了Cav-1沉默后PI3K/Akt、ERK/MAPK通路以及细胞周期抑制蛋白在有或没有PA处理下的变化。结果表明，Cav-1沉默显著促进了PA刺激下的Akt和ERK的磷酸化。随后，我们通过相应通路的抑制剂来阻断Akt和ERK1/2磷酸化则消除了Cav-1沉默对β细胞的促增殖活性。且PA刺激促进了细胞周期抑制子(FOXO1，GSK-3β，P21，P27和P53)的表达，而Cav-1沉默显著抑制了细胞周期抑制子的表达。这些结果均表明，Cav-1沉默通过调控PI3K/Akt、ERK/MAPK通路和细胞周期相关蛋白，促进β细胞增殖，降低PA诱导的凋亡。

        关键点3:Cav-1沉默降低了PA诱导的胰岛β细胞内质网应激

        研究表明，内质网应激可以导致胰腺β细胞功能障碍和细胞凋亡。因此，我们研究了在有或没有PA处理的情况下，Cav-1沉默和ER应激的关系。通过对ER应激标记分子(BiP，XBP-1s，ATF4和CHOP)表达和eIF2α磷酸化的分析，我们发现PA处理激活了NIT-1细胞和原代胰岛中ER应激信号转导，显著上调了NIT-1细胞和胰岛中的ER应激标记分子的表达，并且促进了NIT-1细胞的eIF2α的磷酸化。但是，Cav-1沉默显著降低ER应激标记分子和eIF2α的磷酸化。这些数据表明，Cav-1沉默减轻了PA诱导的内质网应激，这可能参与了其保护胰腺β-细胞功能障碍和细胞凋亡的作用。

        关键点4:Cav-1沉默改善了PA诱导的胰岛β细胞自噬功能障碍

        自噬缺陷与胰腺β细胞的数量减少和功能障碍有关。我们的电镜结果显示，0.25 mM的PA刺激下的NIT-1表现为自噬小体增加，溶酶体和自噬溶酶体缺如，自噬功能失调。高脂刺激下，沉默Cav-1的NIT-1细胞与对照组比较，溶酶体正常，且自噬小体与自噬溶酶体均正常形成，自噬调控过程正常。

        进一步对调控自噬的关键分子的研究结果发现，PA可以引起NIT-1细胞株和原代胰岛的Lc3b、LC3-II和LC3II/I的蛋白水平显著上调。但PA刺激同时引起了自噬后期底物p62降解障碍，表现为NIT-1细胞株和原代胰岛中自噬底物p62分子累积，说明PA刺激下，自噬后期出现了功能障碍，不能正常完成自噬-溶酶体过程以降解有毒物质。另一方面，调控自噬的关键信号通路mTOR，在PA刺激下被显著促进，导致下游Beclin-1转录水平下调，从而影响自噬调控。而沉默Cav-1则表现为更高水平的Lc3b、LC3-II和LC3II/I的表达水平。且PA诱导的自噬失调被有效控制，p62的累积在基因和蛋白水平均被显著下调，说明自噬后期的功能障碍被改善。而PA引起的mTOR信号通路的激活也被有效抑制，引起下游Beclin-1的转录水平上调，自噬被促进。总之，Cav-1沉默改善了PA刺激下的胰腺β细胞自噬功能障碍。